我国茭白( Zizania caduciflora Turcz．)栽培范围很广，长江中下游及其以南均有分布，尤以太湖流域栽培面积最为集中。茭白纹枯病在茭白栽培中普遍发生，主要为害植株的叶片和叶鞘。以前危害较轻，未引起人们的重视，近年来随着茭白栽培品种与栽培方式的改变及施肥水平的不断提高，茭白纹枯病发生日趋严重，一般田块病株率在10％-30％，有时高达60％以上，已成为茭白优质、稳产的严重障碍。在过去的10多年中，陆续有关于该病的研究报道，内容涉及病原鉴定、病害的发生规律及对产量的影响、病害防治、品种抗性等方面。本文综述近年来研究进展和展望未来的研究目标，以期推动今后的研究工作走向深入。
1 研究进展
1．1 纹枯病的病原物 李清铣(1985)在对茭白纹枯病病原鉴定研究中，确认病原菌无性阶段为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)，属半知菌亚门，无孢目；有性阶段为瓜亡革菌(Thabatephorus cucumeris Frank．Domk)，属担子菌亚门，胶膜菌目。初生菌丝无色，老熟时变为褐色，菌丝有分枝、分隔；分枝与主枝多成锐角或近直角，分枝菌丝基部均有明显的缢缩现象，距分枝不远处有一横隔膜，菌丝直径为4-11 m；菌丝的每个细胞具有多个细胞核，为3-5个；病菌在PDA培养基上，菌落生长初期，菌丝稀疏，紧贴于培养基表面，初为白色，后逐渐变为淡褐色；3-4天后菌落表面有白色疏松球状菌丝团形成，后变为大小和形状不一的灰色或近黑色菌核，内部为褐色，比较一致；菌核分布于全皿，但常在皿的边缘菌落先形成，大小0．4-4．5 mm。 立枯丝核菌不产生无性孢子，以菌丝或菌核形态存在，具有形态学、生理学、生态学及致病性的差异和变化。刘立(1987)、梁继农(2002)在菌丝融合群及其致病性测定研究中，认为典型的茭白纹枯病菌和大多数水稻、玉米纹枯病菌同属立枯丝核菌的AGI-IA群，致病性强；梁继农(2002)将茭白纹枯病菌与水稻纹枯病菌交互接种后，发现其发病基本一致，认为两种作物的纹枯病菌为同一病原物。
1．2 影响病害发生的因素 一般而言，影响茭白纹枯病发病的因素可分为两类：一类为不可控因素，主要包括气象因子如温度、湿度、降雨等；另一类为可控因素，主要包括肥水管理、药剂控制、品种布局、减少初侵染源等。 从不可控因素方面看，病菌的发育与致病，适于25-32℃的温度范围和95％以上的相对湿度。在田间，植株内的小气候对病害发生的影响作用尤为明显。徐强(2002)认为，江苏7月中旬-8月中旬气温高、降雨多、田间湿度大，且植株生长旺盛、基部通风透光性比较差，是田间茭白纹枯病发生的主要时期。 在影响该病发生流行的可控因素中，以肥、水、菌的效应较为显著，主要表现在对初侵染、水平扩展速率、垂直扩展速率、茭白孕茭期病情指数等的影响。其中，以施氮量对上述几方面的影响最为显著，其次为菌核量、种植密度和灌溉方式。 徐强(2002)在对该病发生规律的研究中指出，不同茭白品种类型影响着该病的发生与流行。一般而言，植株比较矮小、分蘖多、生长势弱的品种，在重施氮肥和密植的情况下，有利于纹枯病的水平扩展和垂直扩展。不同熟性的品种，对纹枯病发生的影响也不一样，表现为早熟品种比晚熟品种更有利于病害的发生。 尽管茭白品种间对纹枯病的抗性有一定差异，但目前尚未发现高抗品种，一般说来二熟茭比一熟茭较抗病。
1．3 病害对产量的影响 茭白产量是由有效分蘖数、单茭重构成的。徐强(2002)在对茭白纹枯病产量损失测定研究中认为，病害对产量的影响主要是有效分蘖数的降低，其次是对单茭重的影响；病株率、病指愈高，有效分蘖数损失率愈大，产量损失相应也愈大；不同的病级之间单茭重有着显著或极显著的差异，单茭重损失率与病级之间存在着极显著的线性关系。 不同茭白品种类型间，由于生长期的长短、生长势的强弱不一样，病害的危害程度及造成的损失也不一样。一般来说，一熟茭由于植株比较矮小，生长势弱、生长期短，抗病性较差，发病较快，病害所造成的损失较大。而作为二熟茭的不同品种之间，差异也很明显，如在江苏，无锡型品种长势相对较弱，所以病害危害较重，损失较大，而苏州型品种则由于生长势较强，故病害危害较轻，损失也较小。
1．4 病害的防治 尽管选育和推广抗病品种是防治病害的根本途径，但目前茭白纹枯病的防治主要靠合理的栽培措施，并配合必要的药剂加以控制。 有关防病栽培措施的研究报道较多，可归纳为如下方面。 ①实行合理轮作，对难以轮作的老茭田，加强田园清理工作，增施石灰，降酸增钙等。目的是尽量减少田间有害病菌，控制纹枯病初侵染量和水平扩展速率。 ②实行品种的合理搭配，改单一品种为多类型合理种植。 ③保持二定的栽植密度，避免过度密植。一般而言，种植密度维持在每穴0．71 m2左右时，能较好地控制病害的发生和扩展。 ④按不同的生育间阶段加强水分管理，适时、适度晒田。这对降低茭白纹枯病的垂直扩展速率、减轻纹枯病的危害有积极作用。 ⑤肥料管理上，施足基肥，及早追肥，增施磷、钾肥，避免过施和偏施氮肥，提高茭白抗性，减轻危害。 在化学防治方面，很多试验表明，药剂防治关键是把握防治适期，药剂保护重点应放植株上部的几片功能叶上。由于构成产量损失的主要因素是有效分蘖数、单茭重的降低，所以防治适期应在分蘖期和孕茭前期。 过去防治纹枯病的主要药剂是砷制剂如稻宁、田安等，但砷制剂药害较重，孕茭前期难以应用。目前防治纹枯病的药剂主要是井冈霉素，另外还有多菌灵、托布津、纹枯利、担菌宁、禾穗宁、氟担菌宁、苯来特、稻瘟净、克瘟散、地茂散、百菌清等药种。利用拮抗性微生物进行生物防治是控制纹枯病的有效手段之一。逗年来，很多专家研究发现了一些对水稻纹枯病菌有拮抗性的真菌和细菌。有理由相信，这些研究成果将有利于对茭白纹枯病的防治，这对于保护农业生态系统、实现蔬菜的无污染生产具有深远的意义。
2 研究展望 茭白纹枯病的研究，虽然取得了一定的进展，但与其他作物的病害研究相比，仍有较多领域有待进一步展开。
2．1 病原物研究方面 进一步开展对病原物生长习性的研究，如病原菌在田间的初侵染源、生长繁殖、越冬；不同的碳源、氮源等营养条件以及不同的温度条件、pH值对病原菌培养的影响等。开展此方面的研究，可以判明该病菌与其他作物纹枯病是否属于不同的培养型、生理型。另外，将病原菌与有关作物和常见杂草进一步进行人工接种及开展田间自然感病调查，明确病原物与其他作物病害的关系，以利于实现对该病的综合防治。
2．2 品种的抗性和遗传研究方面 尽管目前尚未发现高抗或免疫的品种，但必须加强茭白抗病种质资源的鉴定和筛选，并利用辐射诱变、生物技术等手段创造新的变异，为抗病育种服务。茭白属于无性繁殖，目前主要靠田间定向选择选育新品种(品系)，但仍应开展相关性状的遗传研究，以探明种群抗性变异构成特征，为茭白抗病新品种的选育奠定理论基础。
2．3 寄主的抗性机制研究方面 寄主对病原菌侵染有多方面的抵抗能力，如形态结构对病菌的不适应，生理代谢对病原菌的限制以及抗病物质的产生等。就茭白纹枯病抗性机制研究而言，可从如下几方面展开。 ①植株的形态结构、生理年龄与病害侵染、发生的关系 植物病害的发生和流行往往与植株的形态结构和生理年龄有关，如叶鞘的抱合程度、叶片的开张度，植株的各生长发育阶段等。有关水稻纹枯病在该方面的研究表明，纹枯病菌的菌丝体是从叶鞘内侧侵害稻株组织，而幼龄稻株叶鞘紧包茎基部，但随着株龄的增加，叶鞘变得疏松，菌丝体较易侵入；在抽穗期前，低位叶鞘比高位叶鞘易受侵害，而抽穗之后，高位叶鞘也会受侵染；叶片和叶鞘的感病性以及病斑的大小，随其年龄的增加而增加，通常在抽穗前，低位叶片和叶鞘比高位的易感病，但在孕穗后，较高位的叶片和叶鞘也会感病。茭白纹枯病菌的侵染与发生，是否存在类似的现象，有待于研究，这对于抗病品种的选育、进行合理的栽培管理意义深远。 ②植物组织结构与抗性的关系 植物抗性高低往往与植物组织结构有关，如植株表面蜡质层、硅化细胞、木质素、叶绿素等。植株表面蜡质层、硅化细胞是抵抗和延迟病原菌侵入的一种机械障碍，往往可以作为衡量品种抗感性的指标，也可以作为鉴别品种抗性的一种快速手段。 ③植物组织中的一些酶类活性、病原相关蛋白(PRs)与抗性的关系 如作为氧化酶系统的过氧化物酶(PO)、多酚氧化酶(PPO)，植物次生物质代谢系统中比较关键的苯丙氨酸解氨酶(PAL)等。再则，植物体内游离氨基酸、糖分等的含量高低与作物抗性的关系等等。上述这些，目前在茭白纹枯病的研究中仍属空白，有待于展开。
2．4 病原菌的致病机制研究方面 健康植物的细胞和组织进行着正常有序的代谢活动。病原侵入后，寄主植物细胞的正常生理功能就遭到破坏。病原生物对奇主的影响，除了夺取寄主的营养物质和水分外，还对植物施加机械压力以及产生对寄主的正常生理活动有害的代谢产物，如酶、毒素和生长调节物质等，诱发一系列病变，产生病害特有的症状。开展这方面的研究工作，对于探明茭白纹枯病菌的致病机制，具有重要意义。
编辑推荐
韭菜(Alhbm tuberosum Rottl．ex Spreng．)别名草钟乳、起阳草，百合科葱属多年生宿根草本植物。染色体数32。含丰富的维生素C、碳水化合物及硫、磷、铁等矿物质，尤其富含胡萝卜素和纤维素，还含有辛香的挥发性物质--硫化丙烯，有增进食欲和杀菌的作用。其种子在中药学上称作韭菜籽，含有生物碱及皂苷等。韭菜叶、根和种子均可作中药，味辛、性温，有温中行气、散血解毒的功效。韭菜原产于中国，栽培历史悠久，三千多年前就有献羔祭韭的诗句。韭菜耐寒、适应性强，我国东自滨海，南至海南，西及青藏，北抵黑龙江都有栽培。 我国是韭菜生产大国，每年都有韭菜出口日本，近两年向日本出口的韭菜数量增加了8倍，但韭菜品质一直没有日本本国生产的好。我国已加入WTO，为了保证出口韭菜在海外的市场份额与竞争力，采取相应措施提高品质是非常必要而紧迫的。
1 概况
自德国植物学家Haberland提出植物细胞的全能性理论并进行离体培养探索以来，历经100年，经过科学家们不遗余力的努力探索和研究，植物组织培养逐渐趋于成熟，形成了一门效益显著的技术科学。它不仅在遗传学、生理学及病理学等学科的理论研究上具有重要的意义，而且在植物育种和生产应用上也有着明显的实用价值。对于韭菜组织培养的研究，早在1977年Zee等就已培养韭菜无菌苗幼叶获得了再生苗，但植物的再生频率较低阎。近20多年来，随着国内外对韭菜组织培养研究的增多，现已建立了高频韭菜植株再生体系，为基因工程技术在韭菜遗传改良上的应用奠定了基础。
2 研究进展
2．1 器官片段作外植体的组织培养
①花序培养 郝建平等(1995)将韭薹未张开的花序用0.1％升汞消毒10 min，无菌水冲洗3次，剥去苞片以后，切取内部花序，接种于附加不同种类和浓度的MS培养基上分化形成愈伤组织。愈伤组织在分化培养基中分化成苗或者不经继代直接分化成苗。在含有NAA的培养基中分化生根，形成完整的再生植株。Nair等(1993)诱导山韭花蕾愈伤组织产生，然后在BDS+2，4-D 1 mg／L+BA 3 mg／L培养基中培养再生芽，诱导生根后90％的再生植株能够成活。 ②茎尖培养 茎尖是最常用的外植体。秦波等(2002)rq取生长健壮无病虫害的圣堂野生大叶韭菜为供试材料，清水洗净，剪去叶片和根，切除多余茎段。将消毒好的材料在无菌条件下剥去余下叶，取出茎尖接入MS+2，4-D 2 mg／L+KT 1 mS／L+ZT 1mg／L十蔗糖30 g／L+琼脂5 S／L诱导培养基上，30天后大部分培养基上出现愈伤组织和丛生芽。将诱导组织分切后放入MS+KT 1 mS／L+ZT 1 rog／L+NAA 1 mg／L+蔗糖30 g／L+琼脂5 g／L增殖培养基中，增殖3-5代后，可获得许多不定芽。再将增殖产生的健壮不定芽转入1／2 MS+BA 0．2 g／L+NAA0．5 mg／L+蔗糖30 g／L+琼脂5 g／L的生根培养基上，经过20-30天，可获得大量生根苗，且每一小苗可长出3-5条根。 ③鳞茎培养 贾芬等(1995)将消毒后的韭菜种子接到MS培养基上，待发芽长成小苗时切取鳞茎，接种在MS+6-BA 1 mg／L十3％蔗糖的诱导培养基上，约20天基部出现斑黄色愈伤组织，3-5天后，大多形成黄色小瘤状，表面尖滑，尖端出现小绿点，一周后均形成芽，15天后将长出的丛生鳞茎去掉顶端部分，转接到1／2 MS+I．5％蔗糖的生根培养基中，10天左右下部产生白色小点，并逐渐长出白色不定根，成为完整植株。将试管苗炼苗1天，移栽到培养土中，15-20天后长出新叶即可定植田间，成活率可达85％1：2上。 ④根尖培养 研究表明，韭菜根尖也是培养植株再生的优良外植体。Shuto等(1993)用韭菜的根尖(0．2-0．3 mm)培养，在MS+NAA 1 mg／L上诱导愈伤组织，然后在MS或MS+BA 0．01 mg／L上分化芽和根，形成再生植株。张松等(2002)把消毒后的韭菜种子置于MS基本培养基上，种子萌发后取0．5-1．0 mm的根尖为外植体，接种于MS附加不同浓度的NAA和BA的诱导培养基上。结果发现在MS+NAA 1 mg／L+BA 2 mg／L培养基上可一次成芽，芽分化频率高达65．4％-83．7％，出芽数达40．1-46．7个，在2-3个月的时间内可以获得大量的再生植株。
2．2 单倍体培养
自从San Noceat(1976)用胚珠培养出单倍体起，通过体外雌核发育途径再生单倍体植株成为有些植物上取代花粉(药)培养的有效途径。田惠桥等(1989)用韭菜未传粉子房在MS+ZT 0-2 mg／kg+2-甲基-4-氟苯氧乙酸(Mcpa)上从胚囊中诱导出单倍体植株；同时研究还表明韭菜的反足细胞的胚胎发生频率高于卵细胞。Kojima(1989)建立了花顶培养一胚珠培养一胚培养的再生韭菜双单倍体的培养体系。
2．3 培养基及影响因素
韭菜组织培养常以MS(Murashige and Skoog，1962)为基本培养基，其中蔗糖浓度一般为1．5％-3．0％，琼脂5-7 g／L，pH值5．8-6．0。 ①基因型的影响 张松等对韭菜不同基因型不定芽的分化进行研究，在MS+NAA 1 mg／L+BA2 mg／L培养基上接种不同品种的根尖外植体，30天后调查不定芽的分化情况。结果发现供试的14份材料均能产生愈伤组织和分化不定芽，且产生愈伤组织的外植体多数能再分化形成不定芽，分化数目也较多，愈伤组织分化频率较低的品种出芽率也较低。 ②激素对愈伤组织的影响 研究表明，在韭菜花序的组织培养中，只添加生长素(NAA或2，4-D)的培养基中愈伤组织的生长量很少。细胞分裂素与生长素配合使用，则出愈率较高，其中6-BA的效果优于ZT和KT。适当提高6-BA的浓度(1 mg／L)对愈伤组织的形成有利。高浓度的2，4-D(4 mg／L)对出愈有抑制作用，同时2，4-D浓度过高(2 mg／L)或过低(0．25 mg／L)都会影响愈伤组织的增殖，并且易使愈伤组织褐化。未经继代的愈伤组织在诱导培养基中可直接分化成苗，其中ZT对成苗的促进作用最强。在含有NAA和细胞分裂素的培养基中，愈伤组织的生长状态良好，均可分化出苗。从而得出结论，当单独使用生长素时，可促使韭菜花序脱分化过程的启动和愈伤组织的形成；当细胞分裂素与生长素配合使用时，可显著增加出愈率和促进愈伤组织细胞的增殖。 ③激素对不定芽分化的影响 将韭菜种子萌发10天后长0．5-1．0 cm的根尖接种于附加不同浓度NAA和BA的MS培养基上，3天后从不定芽的分化情况可以看出，NAA和BA对韭菜组织培养的作用显著。在MS+NAA 1 mg／L+BA 2 mg／L培养基上，不定芽诱导频率最高，为80．6％，平均出芽数也最多，达46．5个；MS+NAA 2 mg／L+BA 1 mg／L和MS+NAA 2 mg／L+BA 2 mg／L次之。同时发现易产生愈伤组织的外植体芽分化频率和出芽率均较高。 ④苗龄对不定芽分化的影响 随着苗龄的增加，芽分化频率和平均出芽数呈下降趋势；7-10天苗龄的根尖外植体最适于脱分化和再分化，芽分化频率达83．7％-86．4％，平均出芽数达42．2-46．7个，是最适宜的取材苗龄。 ⑤抗生素对植株再生的影响 在对卡那霉素(Km)和噻孢霉素(Cef)及Timentin对韭菜组织培养影响的研究中发现问，Km对韭菜植株再生有很强的抑制作用，在Km为20 mg／L时就完全抑制愈伤组织和不定芽的发生；Carb和Cef也抑制韭菜根尖培养的植株再生，其中Cef的抑制作用更加显著，当Carb 500 mg／L或Cef 300 mg／L就完全抑制不定芽的再生；Timentin对愈伤组织和芽的分化影响不大，抑制性主要表现在出芽数随浓度的升高而降低，当Timentin浓度为500 mg／L时，平均出芽数仍可达到23．8个，为对照的49．4％，因而可以选择Timentin作为农杆菌的生长抑制剂。 ⑥温度对生根培养的影响 秦波等发现，在其他条件一定时，温度对生根培养影响较大，当温度为(20+2)℃时，组培苗生长健壮；当温度超过30℃时，组培苗生长基本停止，有的甚至死亡；当温度低于15℃时，根系生长良好，但茎叶生长缓慢。因圣堂山野生大叶韭菜生长在大山谷中，喜冷凉的气候，所以得出结论，外植体的培养最好满足其生长环境才能生长良好。
3 问题及展望
随着生理、生化等相关学科的发展，韭菜快速繁殖技术将日趋成熟。对于在愈伤组织培养过程中易产生遗传性变异，特别是染色体倍性的变化，Viterbo等(1992)指出遗传变异是由培养条件引起的，这些变异可用酶的多态性分析，在分化前通过分析酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和过氧化物歧化酶探知，这为预测和预防变异提供了新方法。同时产生较大的遗传变异是选育新品种的基础，因而伴随组织培养技术的日趋完善，可以将植物组培技术与分子生物学方法结合起来，在细胞水平上进行遗传修饰，重组DNA，以改良韭菜品种；也可以与多倍体诱导相结合，从而加速和丰富韭菜的多倍体育种；还可以通过胚培养途径，将诸如山韭具有花期长、抗真菌细菌性病害等的优良性状输入栽培种，以扩大栽培种的基因库。Dommise等(1990)认为与韭菜同属的洋葱是农杆菌的天然寄主，当酚类物质如乙酰丁香酮在农杆菌侵染中的作用被发现后，利用农杆菌介导法将外源基因导入单子叶植物成为可能。目前，我国韭菜的转基因工作也正在进行。 随着生物技术产业化发展的日益加快，植物组织培养技术必将会加快韭菜新品种选育的工作进程，并使韭菜组织培养技术尽早地实用化，增强我国加入WTO后韭菜出口的竞争力。
据统计，自然界中30％-35％的被子植物，70％的禾本科植物属于多倍体，它们是推动植物进化的一个重要因素，是物种形成的途径之一。目前农业生产上广泛栽培的小麦(异源六倍体)、大豆(异源四倍体)、花生(异源四倍体)等重要作物，都是多倍体育种的杰作。而以营养器官或多汁多肉果实供食的蔬菜作物，通过利用多倍体的巨大性，更具特殊意义，是蔬菜优质高产育种的重要途径之一。 自1937年勃莱克斯利(Blakeslee)和艾弗瑞(Avery)发现秋水仙素(Colchicine)诱导染色体加倍的效果以后，掀起了用秋水仙素诱变多倍体育种的热潮。1937年也被称为多倍体新时代的开始。现已经在1 000多个植物种中获得了人工多倍体。蔬菜作物多倍体的栽培利用是以四倍体和三倍体为主，到目前为止，人工诱导获得多倍体的蔬菜作物有：西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄、马铃薯、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、莴苣、菠菜、辣椒、大白菜、丝瓜、石刁柏、生姜、茄子、黄花菜、菜薹、莳菜等，但在生产上大量推广应用的只有西瓜、白菜、马铃薯等。
1 蔬菜多倍体的获得途径研究
1．1 自然突变产生多倍体 一些自然现象如雷电、空气、温度剧变致使植株创伤等有时能诱发四倍体。自然界四倍体形成主要有两条途径：其一是原种或杂种所形成的未减数的配子的受精结合；其二是原种或杂种的合子的染色体加倍。关于自然出现四倍体的频率，多年生植物高于一年生植物，因为多年生植物开花结实的机会更多；白花授粉植物出现多倍体的频率高于异花授粉植物，因异花授粉植物与它株(二倍体)授粉产生三倍体种子而绝种。此外能够自己进行无性繁殖的植物同源四倍体出现的频率高于有性繁殖植物，因此大部分蔬菜作物的四倍体自发突变频率较低。Nugent和Ray从栽培二倍体甜瓜品种'Planters Jumbo'中田间发现了自然突变C899-J2后绿标志的四倍体甜瓜品系，用此四倍体做母本生产出无籽甜瓜。
1．2 人工整体植株诱导获得四倍体 利用一定的物理和化学的方法可以进行四倍体的人工诱发。最早诱发的四倍体是在番茄上通过打顶等机械损伤方法而实现的。利用化学方法诱导主要利用化学试剂如秋水仙素、苯乙烷、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有机砷制剂、有机汞制剂、磺胺剂及其他植物碱。人们主要用秋水仙素诱导植物生长点的办法获得同源四倍体。通过此方法，目前在瓜类、茄果类、根菜类、叶菜类、花菜类等方面都通过此途径获得同源四倍体、三倍体品系。
1．3 通过离体组织培养获得四倍体 随着植物组织培养技术的发展，染色体加倍可通过离体组织培养获得多倍体。通过离体培养获得四倍体可以提高再生植株群体中四倍体的频率，并容易控制实验条件，减少或避免异倍性嵌和体。离体组织细胞染色体加倍有以下途径。 ①利用植物组织培养过程中出现四倍体无性系变异获得四倍体再生植株。Adelberg、Rhodes，Ezura等、Zhang等、马国斌等、何欢乐等用西瓜和甜瓜的未成熟子叶、子叶和真叶作为外植体进行离体培养，利用诱导再生植株过程中发生染色体数目变异，获得了较高频率的四倍体变异。Kunitake等报道石刁柏和胡萝卜的组织培养过程很容易产生四倍体。袁华玲等就利用组织培养获得四倍体石刁柏试管苗。郭启高等在西瓜芽再生培养基中仅添加BA，即可产生高频率的四倍体变异。 ②在培养过程中，用秋水仙素溶液处理培养材料。周朴华等在黄花菜组织培养中，用秋水仙素溶液处理愈伤组织，获得同源四倍体黄花菜新品系。张建军等对于叶菜类的白菜和莴苣，用含秋水仙素的固体培养基处理带3-4片真叶的再生苗，再从中诱导出相应的四倍体。马国斌等对8天左右苗龄的茎尖，在含有0．1％秋水仙素和较低浓度细胞分裂素的液体培养基中处理24-48 h，很好地诱导出四倍体。此外还发现几种除草剂(Trifluralin，Oryzalin等)也具染色体加倍的功能，甚至效果更好。
1．4 有性杂交培育多倍体 指原种或杂种所形成的未减数配子的产生和融合(有性多倍化sexnal polyploidization)。未减数配子即2n配子，它是染色体数目和体细胞相同的花粉或卵。通过单向多倍化(双亲之一为产生2n配子的类型)或双向多倍化(双亲均能产生2n配子)均能提高杂交后代的倍性水平。王子欣报道以秋水仙素处理诱发产生的结球白菜四倍体为母本与二倍体结球白菜杂交，获得了新的同源四倍体。新四倍体的获得是二倍体未减数配子(2n配子)与四倍体的正常2n配子受精结合的产物。这种方法，很可能是改良人工诱发的四倍体的一条有希望的途径。利用2n配子可便利地转移抗性基因。马铃薯细菌性萎蔫病是发生在湿热条件下的严重病害，四倍体栽培种的抗性较弱。Watanabe等(1992)用抗病的二倍体与感病的四倍体杂交，获得了抗病的四倍体后代。通过2n配子，在二倍体水平上杂交，可直接获得三倍体而不需四倍体亲奉。
2 蔬菜多倍体植株的形态特征研究 当染色体组成倍增加之后，其细胞核与细胞质的比例关系发生变化，各染色体在减数分裂过程中有可能发生不均衡分配、基因的剂量效应和基因的互作效应等都会破坏原有的生理生化功能的平衡，致使植株发生一系列变化。
2．1 多倍体檀株性状的巨大性 染色体的同源倍数越多，细胞核和细胞的体积越大，叶片大小、厚度、气孔和花粉粒大小、花和种子大小、茎的粗度也随之递增，这种特征称为多倍体的巨大性。多倍体植物的巨大性不是绝对的，不同倍性不同器官表现不同。如柴兴容等等通过秋水仙素诱导甜瓜植株获得的各种甜瓜四倍体，薄皮甜瓜、厚皮甜瓜、哈密瓜等的四倍体，果实反而比二倍体变小，长形和大型果实变小程度更加明显；果肉增厚，种腔变小；其他植株性状仍然呈巨大性。
2．2 多倍体檀株的生长发育一般比二倍体慢 开花且成熟较迟，分枝能力减弱，但适应性增强。生长发育缓慢与细胞分裂缓慢有关，生长素含量少也是重要因素，此外，因细胞体积增大，细胞的表面积与体积之比相对减少，从而引起一系列的代谢过程，如呼吸强度、蒸腾作用降低，使发育延缓。刘文革等测定西瓜四倍体的植株叶片的单位重量光合色素含量比相应的二倍体低，但叶比重、叶片叶面积、单位叶面积上的光合色素含量是随着染色体倍性的增加而增加。近年来随着转基因研究和对基因互作的深入研究提出了基因沉默和共抑制假说，从另外一个角度解释了植物的性状并不一定随着倍性的增加而增大的原因。
2．3 同源四倍体的低稔性和同源三倍体的不育性 李爱华等对同源四倍体的黄花菜的减数分裂行为及其育性的研究得出，减数分裂的不正常，形成配子的染色体数目不平衡，是造成部分不育的细胞学原因。Quadt等对番茄四倍体研究发现细胞增大和稔性降低间的相关，稔性和染色体配对情况也无明显相关，认为稔性主要受基因型控制。邹道谦等认为四倍体番茄稔性低的主要原因是胚珠受精率低。谭素英等以西瓜四倍体和二倍体为试材，从授粉、受精和胚胎发育的角度进行研究得出，花粉萌发率低、胚囊受精率低、胚乳过早解体、大多数胚在发育过程中败育，是同源四倍体西瓜低稔性的胚胎学原因，孕性也受环境因素的限制。 同源三倍体的无籽西瓜和自然形成的三倍体香蕉和黄花菜，一般是高度不育的，没有种子。有些作物4X和2X杂交，得不到成熟的3X种子。刘学岷等、胡金良等对4X和2X的小白菜的胚胎学研究表明，4X和2X的受精和早期胚胎发育正常，由于胚乳过早解体，胚发育到球形原胚时发生退化，因而无法获得成熟的3X种子。Malepszy等对黄瓜的研究，由于4X和2X的正反交无法得到成熟种子，就通过对其进行胚挽救，得到3X植株，但正反交得到的3X植株特征并不一样。Ezura等通过胚挽救获得三倍体甜瓜。张成合等队为引起异倍体间杂交不稔的原因主要是胚胎在发育过程中发生败育，胚乳提前退化。
2．4 生物化学和次生代谢成分增加 由于生长缓慢，代谢强度改变，多倍体的化学成分，如氮、碳水化合物、维生素、植物碱含量增加。例如，一些药用植物如罂粟的多倍体所含的吗啡比二倍体多。三倍体的西瓜和甜瓜的含糖量、四倍体番茄和甘蓝的Vc含量比相应的二倍体含量高。刘选明等对获得的同源四倍体黄花菜进行分析得出，四倍体的蛋白质含量、总糖含量等比相应的二倍体大幅度提高。
2．5 多倍体植株的抗逆性 许多研究表明，植物多倍体的抗逆性比相应的二倍体高。三倍体和四倍体西瓜对枯萎病有较强的抗性，可连种多茬。四倍体的萝卜对普通根肿病的抗性比二倍体高。张建军等对莳莱四倍体的抗热性研究表明．植株的巨型性是耐热四倍体增产的主要因素。刘惠吉等对不同倍性不结球白菜的体细胞质壁分离状况研究表明，四倍体白菜细胞的原生质水合度变化小，粘滞性强，因而受逆境的胁迫变化小，从而导致抗性增强。刘文革等用NaCl琼脂固定法对蜜枚西瓜的二倍体、三倍体、四倍体在不同浓度。NaCl胁迫下发芽种子成苗率、下胚轴长、根长、侧根数等比较，当NaCl浓度在90 mmol／L以上时，不同倍性之间有明显差异，四倍体耐盐性明显比二倍体强。
2．6 产生多倍体优势的内在原因 ①重复基因的剂量效应。由于不同染色体组之间往往具有一定的同源性，这就使得一些具有相同功能的基因产生剂量效应，由此表现出优于亲本的优势。 ②基因的遮盖作用或上位效应。由于不同染色体上的同功基因在表达上是一致的，其中如有一不良基因也会因其它基因的遮盖而对整体表现难以产生大的影响，使机体能正常的生长。 ③重复基因的显性与超显性作用。位于不同染色体组上控制同一性状的基因可以与同源染色体上的等位基因一样产生显性与超显性作用。 ④等位基因间的互作。由于多倍体中不同染色体组上重复基因的相互影响，同源染色体上等位基因的杂合性可以在选择中得到长期保持。 ⑤非等位基因的互作。一般而言，一个性状往往是由不同的代谢途径控制的。多倍体的遗传体系较为复杂，这种情况就更容易出现。如果一个染色体组上控制某一性状的基因表达受阻，不仅同一组内的非等位基因可以补替，其他染色体组的基因也会补替而使性状得以表达。
3 蔬菜多倍体研究的应用 多倍体育种在蔬菜上的应用已有70多年，科学家们培育出很多种类和类型的多倍体蔬菜品种，蔬菜作物多倍体能提供人们比二倍体更多或更优良的水果、蔬菜类型。
3．1 利用多倍体的巨大性获得大的果实或营养器官产品，使蔬菜作物增产 日本于20世纪40年代育成的四倍体美浓早生萝卜，性耐寒，生长旺，肉质根长而大，呈白色，多汁味甜，生食或熟食，产量提高20％左右，抽薹晚。在瑞典，芜菁已经用四倍体品系来加以改良。刘惠吉等选育第一个不结球白菜四倍体品种南农矮脚黄小白菜四倍体品种，其表现比二倍体，叶色变深，叶片变厚增大。其产量较二倍体增加20％-30％。抗逆性明显提高，已大面积应用于生产。在60年代末和70年代初，前苏联和日本诱导出的同源四倍体南瓜(包括中国南瓜、两葫芦和笋瓜)，它们的产量明显超过二倍体，增幅达105％~300％。
3．2 利用多倍体可孕性低来获得无籽或少籽的果实 无核果实在商业上具有特别的价值，三倍体无籽西瓜是目前在生产上利用同源多倍体面积最大的植物品种之-。三倍体无籽西瓜是三倍体水平的杂交一代西瓜，具有多倍体和杂交一代的双重优势，其适应性和抗逆性更强，含糖量高，无籽，耐贮运，产量高，深受消费者和种植者欢迎。蜜枚无籽一号、黑蜜无籽二号、郑抗无籽、雪峰无籽、洞庭无籽等已经成为我国西瓜的主栽品种。其他瓜类的三倍体无籽植株也已获得，但还没有在生产上应用。李树贤等选育的同源四倍体茄子品种新茄一号，其平均单果种子数324粒，仅为二倍体品种六叶茄的9．5％，为少籽高营养品种。
3．3 利用多倍体营养成分和品质的提高，成为蔬菜优质育种的主要途径之一 刘惠吉等培育的四倍体不结球白菜南农矮脚黄，Vc增加30％，还原糖增加24％，粗纤维却减少12．7％。氨基酸总量增加4．14％，Ca、P、Fe三种矿质元素的含量成倍或数倍增加。综合品质为嫩、鲜、甜。瓜类蔬菜四倍体的可溶性固形物含量一般较二倍体高10％~30％。同源四倍体茄子品种新茄一号的果实Vc、脂肪、蛋白质含量分别较对照二倍体品种增加了74．38％，31．30％和34．22％。
3．4 利用多倍体蔬菜抗逆性强，扩大栽植区域和栽植周期 在长江流域，夏季炎热，主要叶菜类蔬菜由于抗性较差，在夏季经常出现短缺，刘惠吉等利用四倍体抗逆性，选育出一系列的抗热白菜四倍体品种，如南农矮脚黄、热优二号等，由于抗病性、抗热性品质明显优于二倍体，正好弥补了叶菜夏淡状况，'寒优一号'又适合冬季栽培，这些品种很快得到推广，目前栽培面积已超过20万公倾。在南方种二倍体西瓜，遇到雨季，容易生病烂果，常给瓜农造成很大损失，三倍体无籽西瓜由于抗病耐湿耐热，在南方很快得到推广。
3．5 利用染色体多倍体化克服远缘杂交不孕不实性 利用多倍体做亲本，高染色体倍数水平有利于远缘杂交。例如甘蓝和野油菜作为二倍体相互不能杂交，但是，作为诱导成四倍体后可杂交。K．Szteyn(1959)报道秘鲁番茄和多腺番茄杂交中，如将母本植株先诱导成同源四倍体，结籽率比以二倍体为母本的增加80倍。
3．6 利用染色体加倍人工创造新的作物类型 Karpechenk等进行了萝卜与甘蓝不同属间的杂交，由杂种的染色体加倍而育成了异源多倍体萝卜甘蓝，论证了人丁创造新种的可能。日本园艺试验场在60年代育成了大白菜与甘蓝的远缘杂交新人工合成种白蓝，它是采用有性杂交后的杂种胚再进行染色体加倍的，是异源四倍体。其品质和风味与莴苣相似，多汁味甜，可做生食、腌渍、榨汁等利用，另外对软腐病的抗性超过双亲。目前，白蓝已在日本的东海地区已有所栽培。但自然形成的异源多倍体的蔬菜很少，如芥菜、欧洲油菜等。
3．7 利用多倍体可以创造非整倍体，如三体、单体添加系等 Bemis通过对南瓜的栽培种和野生种的加倍、杂交、回交创造所需的三体。Struss等用黑芥(BB)、芥菜(AABB)、阿比西尼亚芥(BBCC)等不同来源的Brassica属的种间杂种的B染色体转到甘蓝型油菜(AACC)的加拿大品种Andor上，得到单体添加系(AACC+IB)，用RAPD等手段标记了B组染色体，将10个引物的12个标记分别定位在6条B染色体上，促进了染色体遗传图谱的建立。申书兴等对同源四倍体大白菜游离小孢子培养，获得109个三体株系，克服大白菜二倍体与四倍体杂交不育，不能通过三倍体获得三体的困难，为大白菜三体系的创建提供了新的途径。
3．8 染色体加倍是物种演变的重要途径之一 根据物种染色体的倍性变化来说明物种的进化。Harlan(1975)在研究植物多倍体起源的基础上，认为自然界多倍体形成的主要路线是有性多倍化。芸薹属Brassica物种间的关系可以说明杂交与染色体加倍及物种形成的密切关系，即经典的U三角关系。这6个物种为中国油菜(AA，n＝10)、黑芥(BB，n＝8)、甘蓝(CC，n＝9)、芥菜(AABB，n=18)、欧洲油菜(AACC，n＝19)、阿比西尼亚油菜(BBCC，n＝17)。Waters等(1996)发现这些异源多倍体种同时具有两个二倍体祖先的植物核rDNA重复序列，而且在欧洲油菜和阿比西尼亚油菜中，两个亲本rDNA序列的摩尔数相等，表明其中rDNA未发生同步进化。
4 需要解决的关键问题
4．1 克服蔬菜多倍体的低稔性 刚诱导成功的四倍体其孕性是很低的，笔者在诱导西瓜同源四倍体过程中发现，由于植株受到秋水仙素的毒害，生长异常缓慢，雌花出现很少，自交坐果很困难，往往坐不住果。坐果后，种子很少，有时只有10粒左右或更少。随着种植世代的增加，其孕性慢慢恢复。但四倍体西瓜种子最多也只有100粒左右，仍是二倍体种子数的1／5-1／10，采用适当的育种方法如混合选种、品种间杂交等措施也可使孕性提高。很多试验证明采用增施磷、钾和镁、硼等微量元素促进同化物质的运转等栽培措施可以提高孕性。
4．2 通过大量的四倍体原始材料进行选择 人工刚诱导成的多倍体只能代表未成熟的多倍体，其基因型是未经选择的而且是不平衡的，应该在大的多倍体群体上进行有效选择，才能获得理想的多倍体。不要刚诱导出的少数多倍体性状不好，就否定多倍体的优势。当然此项工作是很艰苦的。
4．3 确定合适的倍性为育种目标 每一物种有它能忍受的最适宜的染色体数目，超过或低于这个适宜的数目，表现常常是不好的。有时是三倍体最合适，而不是四倍体或二倍体。
4．4 对不同倍性蔬菜，采取相应的栽培方式 三倍体无籽西瓜的栽培，主要存在三低(采种量低、发芽率低、成苗率低)，但通过异地采种、破壳高温催芽、人工授粉等措施，使无籽西瓜容易栽培，并得以大面积推广。在美国，无籽西瓜的面积已经占西瓜总面积的30％左右，发展势头迅猛。
一百多年前，已经有脐腐病是一种生理病害的报道(Selby,1896)，到了20世纪40年代，有人通过试验证明番茄脐腐病与钙素营养存在着一定的关系。目前普遍认为缺钙尤其是果实顶端缺钙是引起番茄脐腐病的主要原因。但是以此为理论依据还不足以解释番茄脐腐病发生的机理。尽管脐腐病的研究历史已过百年，但导致其发生的原因还没完全搞清楚。
1 发病症状
脐腐病发生时，首先在果实顶端出现一个或几个凹陷的斑点，渐渐变为暗绿色的斑块。从发病开始大约一周后，病斑扩展到最大面积，最后收缩或萎陷，在胎座的顶端形成一凹陷的革质状枯斑，病斑附近的果皮也从褐色逐渐变为黑褐色。脐腐病一旦发生，果实会提前成熟，并且比正常的果实小。脐腐病的初始发病期一般是在开花后的12-15天，这一时期果实体积增长相对较快，对钙的需求量相对较大，容易引起局部缺钙，导致脐腐病的发生。但是也有学者认为在果实发育的任何阶段都可发生。
2 缺钙与番茄脐腐病
之所以把缺钙作为导致番茄脐腐病发生的主要原因，是因为在番茄果实的顶端，Ca2+的含量最低，并且通常情况下发病果实中Ca2+的含量比正常的果实低。在Ca2+含量非常低的土壤中种植番茄，脐腐病的发生率较高，并时常伴随着其他症状，如叶片失绿，根和茎的伸长受阻，根尖、茎尖坏死等，因此在果实膨大期，喷施钙肥，尤其是在缺钙的条件下，可以降低脐腐病的发生率。 起初把脐腐病的症状表现归因于细胞壁失去了弹性，后来发现在细胞萎陷之前，由脐腐病引起的症状已表现出来。众所周知，钙对维持膜的完整性和选择透性是必需的，有人认为，脐腐病发生时，由于缺钙而导致膜的完整性受到破坏，增加了通过细胞膜离子的种类和数量，结果导致膨压丧失，细胞液进入细胞间隙，使发病早期出现了水渍状病斑。但是有些学者发现发生脐腐病的果实与正常的果实相比，钙的含量没有大的差别。Franco(1999)发现即使果实顶端Ca2+浓度很高，也有脐腐病发生相当严重的现象。如果植株生长缓慢，即使在缺钙的条件下，脐腐病也不会发生。
3 环境的影响
3．1 生长抑制因子
盐胁迫、水分胁迫和铵毒害都可以诱导脐腐病的发生。自从Robbins(1937)报道增加盐的浓度会阻碍植株的生长、果实的发育，提高脐腐病的发生率以来，许多学者对高盐诱导脐腐病的发生做了大量的试验，取得了与Robbins相吻合的结果。但是也有人得出与此相矛盾的结果，对栽培在棉渣上的番茄增施NaCl，既没有提高脐腐病发生率，也没有降低果实中Ca2+的含量。所以，关于盐与脐腐病之间的关系还有待进一步证实。 关于水分胁迫与脐腐病的关系，也有众多的学者进行了研究。Selby(1896)首先提出脐腐病的发生与土壤干旱有关。有的学者认为脐腐病的发生不能完全归因于水分胁迫，而是水分胁迫加重了脐腐病的发生。Obreza等发现当水分胁迫增加时，脐腐病发生率只是偶尔有增加的现象。据Adams等(1993) 报道，土壤含水量过高可以提高脐腐病的发生率。 Robbins(1937)、Gerard(1968)等发现不仅植物吸收水分受阻加重了脐腐病的发生，而且过高的蒸腾速率也可以提高发病的机率。 在高温等逆境条件下，铵态氮肥阻碍了植株的生长，果实的发育，并且提高了乙烯的放出量，引起叶子的偏上生长。因此施用铵态氮肥或增加肥料中NH4+／N03-的比例都可以提高脐腐病的发生率，加重病情。沙培番茄在坐果期施用铵态氮肥，一周内就会诱导脐腐病的发生。 以上这些因素通过间接地阻碍Ca2+向果实的供给导致局部缺钙而引起脐腐病的发生，其发生机理主要有三个方面：①阻碍根部对Ca2+的吸收；②使Ca2+在植株中的运输受阻；③叶片与果实对Ca2+的竞争效应。
3．2 生长促进因子
一些促进植物生长的因子也能诱导脐腐病的发生。在有效氮浓度较高的情况下，植株生长较快，而脐腐病发生的机率也相应的提高，尤其是在第一穗花开放之前，植株生长过快更容易诱发脐腐病。在果实膨大期，如果增加光照时间，提高温度，或者提高温度与增加光照相结合，这些生长促进因子都可以提高脐腐病的发病率。由此看来，在番茄花期喷施一些生长抑制剂可以降低脐腐病发生的可能性，如施用GA合成抑制剂或堆肥来降低氮的吸收等。 有些学者认为，生长旺盛的植株脐腐病的发生率较高是由于细胞膜的生物合成需要较多的Ca2+，尤其在果实膨大期，细胞分裂和生长迅速，供应的Ca2+不能满足果实发育的需要。但是这不能解释为什么在很多情况下生长迅速和易发病的品种却不发病。
3．3 各因子间的相互作用
从上面的内容可以看出，脐腐病发生并不能只归因于某单一因子。对于Ca2+与番茄脐腐病之间有着密切的关系，很少有人怀疑。但是很多学者认为其他因子也起着非常重要的作用。水分胁迫与较高的蒸腾速率，水分胁迫与较高的温度，高温与高浓度的NH4+，盐胁迫与高温等各因子之间的相互作用增加了番茄脐腐病发生率，加重了发病果实的症状。 生长抑制因子和生长促进因子相互结合也可能导致番茄发生脐腐病。Adams等(1993)指出，脐腐病发生的原因通常是光照、温度和影响Ca2+吸收的环境胁迫共同作用的结果。而温度(大气温度和土壤温度)可能是诱发脐腐病的主要环境因子。在高温、营养过剩、盐胁迫的条件下，脐腐病发生的可能性大大提高。 不同因子作用的先后顺序对植株的生长发育有着非常重要的影响。开始灌溉条件较好的植株移到干燥的环境中，或者遮荫条件下生长旺盛、果实正常的植株移到没有遮荫的温室中，脐腐病的发病率会大大提高，同样的植株，如果光照的时间较短，移到光照较强和温度较高的环境中，就比那些经过较长时间光照处理的植株较易发生脐腐病。
4 小结
番茄脐腐病发生的原因是多方面的，很难说每次发病是由哪种具体的因子引起。大部分的报道都是从环境因子与Ca2+相互作用探究其发生的原因。Pill(1978)提出番茄脐腐病是一个数量性状的现象，是多因子相互作用的结果。 无论是对番茄还是对其他作物，快速生长的器官内Ca2+浓度的降低和K+／Ca2+比例的升高都是反映生长速率的重要生理指标，且生长速率与GAs的生理活性密切相关。喷施外源GAs可以提高番茄脐腐病的发病率。因为GAs能够阻碍Ca2+吸收和运输。喷施GA生物合成抑制剂可以提高植株内Ca2+的浓度。Ca2+能够保护膜的完整性，降低渗透性，阻止胁迫因素引起的离子渗漏，GAs与Ca2+有着相反的作用，它可以破坏膜的完整性，增加膜的透性。因此对脐腐病敏感的品种不仅会由于Ca2+浓度太低而发病，而且GA的水平也有着非常重要的影响。当在番茄幼果中发现较高浓度的有生理活性的GA、较低的Ca2+浓度时，脐腐病发生的可能性就比较大。 但是，植株生长旺盛，Ca2+浓度较低并不一定预示着脐腐病发生的机率就高。因为细胞膨压的丧失和溶质的渗漏，可能只在由于各种胁迫因素如高盐、土壤水分缺乏、铵中毒而引起的膜完整性受到破坏时发生。当然，这些胁迫因素只有超过一定的限度才会诱导发病，而轻度胁迫还可增加植株对逆境的忍耐能力，降低脐腐病发生的机率。因为在轻度的逆境下，可以诱导ABA的合成，ABA可以降低GA的活性，提高植株对Ca2+的吸收能力。 综上所述，Ca2+在发生番茄脐腐病原因中所担当的角色应该重新定位。尽管缺钙与脐腐病的发生有着密切的关系，但是不能再把它看成是第一位的或独立的因素，番茄脐腐病发生的主要原因可能不只是因为果实中Ca2+浓度过低。因此，控制番茄发生脐腐病的措施不应该只集中在提高果实内Ca2+的水平上，而应该综合各个方面的因素，使植株保持适宜的生长速度，避免生长环境的急剧变化，减少几种环境胁迫同时发生的可能性，从而达到预防脐腐病发生的目的。
油菜是世界温带农业区最重要的油料作物，但收获前和收获时的裂果现象容易给生产造成严重损失。由裂果造成的损失一般可占籽粒总产量的8%-12%，如收获延迟，产量损失可能增加到20%以上。据估计，每平方米土表累计约有10 000粒种子落下，其中有不少种子在土壤中遇到缺氧等逆境胁迫而诱导产生二次休眠，如在欧洲等油菜一年一熟制地区土壤中可存活多年，最长可达10年，并逐渐产生大量油菜自生苗，影响下茬作物的生育并导致生物混杂，进而降低品质。通过提前收割或喷施干燥剂可提高成熟一致性，但未成熟种子中的叶绿素对油分有影响。增强油菜品种的抗落粒性可提高籽粒成熟一致性，从而降低生产成本，提高种子收获效率和菜籽油的品质。因此，研究油菜裂果抗性具有十分重要的意义。 在芸薹属的芥菜型油莱、埃塞俄比亚芥、黑芥中已发现裂果抗性变异，某些材料表现抗性较好，而现有甘蓝型油菜品种，裂果抗性变异很小，很难进一步发掘甘蓝型油菜品种的裂果抗性材料。Morgan等通过甘蓝与白菜型油菜的种间杂交，获得一批遗传变异很大的人工甘蓝型油菜合成种，包括部分抗角果开裂特性的品系。有关研究表明，培育具良好农艺性状的抗裂果油菜品种，首先取决于植株株型特征研究，包括整个植株和花序的形态特征、单个角果的形态特征以及各性状之间的相关性等。但到目前为止，将抗裂果性状导入甘蓝型油菜还存在许多困难。
1 角果形态构造及开裂过程 油菜果实是圆筒型的长角果，由2片线状果瓣组成，两果瓣间有假隔膜相联。果瓣两侧有包含离区的连接处，由一层简单的薄壁组织细胞组成，离区位于果瓣边缘和包含有通向果柄的主要维管束的中央假隔膜之间。离区细胞在角果衰老时发生分离，角果完全成熟时即彻底分离，随后果瓣裂开。随着果瓣脱水，位于包含维管组织的木质果瓣与隔膜结合处的分裂区细胞发生分离，促使角果开裂。伴随着多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturo-nase，PG)胶质减少，分裂区细胞沿果瓣中线分离，接着分离区细胞壁破裂。分裂区细胞分离发生在开花7周后，即水分完全丧失之前。角果开裂所需的力来自于角果与其它角果、花序接触或收获机械的作用，使果瓣与隔膜的跨分裂区的连接微管断裂，最终使角果开裂。
2 裂果抗性评价 人工合成的不同基因型甘蓝型油菜的裂果抗性存在差异。Morgan等对人工合成的不同甘蓝型油菜品系的株高、茎粗、15cm花序上的角果数与结角密度、分枝数、果瓣厚度、角宽、种子重、角果着生角度、喙长、角长、每角粒数、花序宽、裂果抗性田间评分、20s挤压完整角果数、角果开裂需力等多个性状及相互关系进行了研究。结果表明，正反交材料之间裂果抗性表现相似，具明显抗性差别的材料来源于人工合成甘蓝型油菜品系DK1和DK3[DK1由人工合成甘蓝型油菜(B.rapa chinensis X B.oleraceaalboglabra)与甘蓝型油菜(N-0109)杂交而成；DK3是DKl的反交材料]与来源于Westarl0的品系DK4和DK5[DK4是由双单倍体春甘蓝型油菜(Westarl0)与甘蓝型油菜(N-0109)杂交而成；DK5为DK4的反交材料]及其它栽培种之间。与DKl和DK3相比，DK4和DK5表现为植株较矮，自然宽度较小，株型松散。DKl和DK3的裂果抗性田间评价平均值比DK4和DK5及其它栽培种的田间评价平均值高，且品系内株行之间裂果抗性田间评价值变异幅度较大。 从统计上分析各测定性状间的关系表明，角果开裂需力、随机挤压检测与裂果田间评价之间呈极显著正相关，而角果开裂需力与喙长、角长和每角粒数等呈负相关。角果皮厚度与随机挤压20s后的完整角果数、角宽和角果着生角度呈显著正相关，与角果开裂需力、裂果抗性田间评价、15cm花序角果数呈正相关，与喙长呈负相关。 根据各显著相关性状间的决定系数，将测定的性状分成3个基因组：形态性状、花序性状和角果脱落评价性状。各组性状均相互独立，因此在育种中可独立选择或淘汰。随机挤压20s后的完整角果数与植株高度具有相关性；喙长与角果开裂需力相关，但相关性较低(r=-0.610)，变异系数仅37%。因此，在育种实践中，喙长只能作为甘蓝型油菜裂果抗性选择的参考指标之一。 从扫描电镜下观察到，裂果抗性不同的人工合成甘蓝型油菜品系间，角果维管组织的范围、位置和数量有相当大的差异。裂果抗性强的人工合成甘蓝型油菜品系，果瓣分裂区的维管束体积较大，与花柄相连的维管束沿分裂区的内壁有较多的维管组织。不同品系的角果分裂区细胞分离程度也有很大差异，裂果抗性弱的品系，其细胞分裂区表面粗糙；相反，裂果抗性强的品系，由于分离区的细胞沿单室分离，分裂区表面光滑。 电镜观察的解剖学差异表明，不同品系控制抗裂果的物理及生化机制存在差异。裂果需能较多的晶系，其分裂区的维管束数较多，分裂区内细胞的细胞壁解离减少，这些差异造成了角果开裂所需的力不同，因此产生了裂果的抗性。 Josefsson认为裂果抗性提高与果瓣连接处木质化的增加有关。诱导突变体解剖分析表明，随着连接果瓣和中隔膜的木质化细胞桥的形成，分离区的细胞加厚，通过果柄维管束连接果瓣的初微管痕(prominent vascular traces)接近于分离区内侧边缘。很显然，这些结构的改变与抗裂果性的提高有关。
3 提高裂果抗性的机理
3.1 调节激素和酶的活性 增加角果开裂所需的力，阻止或减慢离区细胞壁的分离，有助于提高裂果抗性。Child研究表明，IAA可减少离区对乙烯的敏感度；当IAA含量下降时，离区细胞对乙烯易起反应，因此，IAA与乙烯的相互作用有可能决定细胞壁是否开始分离。用功能类似于IAA的人工合成生长素2-甲基-4-氯苯乙酸(2-methy-4-chlorophenoxyacetic acid，4-CPA)处理抽菜植株，其离区细胞分裂延迟，完熟角果开裂需更多的力。当IAA含量较低时，角果果瓣内产生的少量乙烯足以激发离区细胞的分裂。乙烯含量的短暂呼吸峰发生在开花5周后(植株衰老之前)，并且乙烯大多转移到种子中。对成熟角果生化分析表明，纤维素酶活性与离区细胞分离有关，随着角果组织中乙烯呼吸峰的降低，纤维素酶活性提高。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)的1个同功酶(PG35-8)的活性与离区细胞中间片层的破裂有关。因此，通过遗传操纵以产生抗裂果性状的植株，有2个途径可以利用，一是保持分离区细胞中IAA的活性，二是抑制离区细胞的细胞壁分解酶的活性。
3.2 辐射诱导产生突变 Kadkol等人发现，甘蓝型油菜栽培种的角果开裂所需力一般为0.05-0.21mJ，如油菜品种JetNeuf角果开裂需力在此范围之内。然而，JetNeuf经辐射诱变后，突变体角果开裂所需力为亲本的4倍，表明辐射诱导突变可使甘蓝型油菜的抗裂果性显著提高。尽管辐射诱导突变可提供大量裂果抗性资源，但由于其可育性很低，不能与其它栽培种进行杂交以分离抗性株系，因此尚不能直接应用于育种。
4 展望 抗裂果性强的植株一般表现株型高大、茎秆粗壮、角短、角皮厚、喙短等特性，而这些特征与所需的优良农艺性状尚有较大差距。把抗裂果性状导入油菜栽培品种，目前尚存在一定难度：甘蓝型油菜品种的裂果抗性变异小；客观评价裂果程度方法尚不完善；角果、花序和株型构造等都可影响角果开裂，增加了研究的复杂性；由于芸薹属各个种之间有关性状的转基因技术、特别是标记辅助技术目前尚不完备，因此分离和转育抗性基因还存在困难。 目前，Morsan等进一步对上述人工合成的不同甘蓝型油莱晶系的籽粒品质性状与化学组成、DNA分子差异与多态性以及其他遗传特性与育种应用潜力等开展了深入研究。随着胚挽救、转基因技术及分子标记辅助育种等新技术的不断发展和应用，并结合常规选择育种方法，将裂果抗性与适当的遗传背景相结合应用于育种及生产实际，是大有可为的。
茄子是一种重要的作物，在蔬菜中排名第四。为害茄子的两大病害是黄萎病与青枯病，黄萎病20世纪50年代初仅在东北局部地区发生，随着茄果类蔬菜面积扩大而迅速蔓延；80年代中期以来，北方部分地区发病田块达40％-100％，发病范围日益南扩。青枯病主要发生在长江流域，一般可致减产20％-30％，严重时可损失50％-60％。由于这些病害的影响，使得茄子产量和品质降低，而且，至目前为止，还没有发现有效的杀菌剂。尽管轮作可起到一定的防治作用，但实施比较困难，所以经济、有效的对策是选育抗病品种。但抗病育种也存在两个问题：一是栽培品种中没有抗源基因，野生种虽有抗性基因，但与栽培品种有性杂交较难，即使能有性杂交，也会引起杂种不育、不稔等问题；二是用常规育种的方法转育抗病基因，转育时间较长。通过生物工程技术的手段，如体细胞融合能越过有性杂交的障碍，将目的基因直接或间接转入茄子的基因组内等，为解决这些问题提供了新的途径。本文就茄子在体细胞融合和遗传转化等方面的研究进展作一个综述。
1 体细胞融合 在茄子的野生种及近缘种中，有许多具抗病、抗虫、抗逆等优良性状的材料，利用潜力大，但它们与茄子的栽培品种杂交时，存在许多问题，如有性杂交困难，或虽能进行有性杂交，但杂种不育或不稔。离体胚培养对克服合子胚形成后的胚胎发育障碍发挥了积极作用，但对合子胚形成前的受精障碍等则无法解决。此外，有性杂交很难形成细胞质杂种以实现胞质基因控制的有益性状，如雄性不育、除草剂抗性的转移。因此，体细胞融合技术为解决茄子生产上的上述问题带来了希望，开辟了新途径。 最早进行茄子体细胞融合试验的是S．Cleddie (1986)，他获得了26个非整倍体杂种再生株，经检测，杂种株对根结线虫具高度的抗性，也具有抗螨的潜能。但由于杂种的高度不育性，其在育种实践上无应用价值。之后又获得了抗根结线虫和螨、抗细菌及真菌性枯萎病、有除草剂抗性的体细胞杂种。而且有的杂种株有非常高的果实产量，达到9 kg／株，是其亲本的3-4倍。 近来，属间体细胞杂交获得了成功。Toki(1990)用带有三个突变的烟草与茄子作了尝试，之后，Guri(1991)在番茄与茄子之间进行体细胞杂交，只在愈伤组织上获得了叶原基，后来，其中一个亲本的原生质体在融合前经-射线处理后，再进行融合，获得了正常的再生植株。
1．1 体细胞融合的技术 PEG法是应用最多的一种化学诱导方法，茄子的原生质体融合多采用此方法，近年来此方法经过改进，发现在PEG诱导液中加入二甲基亚砜(DMSO)可提高诱导频率。 电场融合是目前最流行的物理诱导方法，此法在茄子中的应用也较多。此法的优点在于避免了化学药剂的毒害，且大大提高了融合频率。近年来发湖南农业大学园艺园林学院展的物理诱导法，如聚集的微束激光技术，需要特殊设备，因而在茄子的体细胞融合中应用较少。
1．2 杂种细胞的筛选 目前在茄子体细胞融合的杂种细胞的筛选上，一般采用以物理或化学特性的差异来辨别和筛选的方法。Gleddie等(1986)根据两融合亲本的物理化学特性的差异，即一个亲本具氮尿嘧啶(AU)的抗性，另一亲本在含ZT的再生培养基上分化的芽能产生花青素，而选出既具氮尿嘧啶抗性又能在芽分化时产生花青素的组织，即体细胞杂种。Guri等(1988)也是根据两亲本的差异，即一亲本在KM诱导培养基上不能分裂，而另一亲本在芽分化时能产生独特的淡绿色的物质来筛选杂种细胞。
1．3 体细胞杂种的鉴定 目前茄子体细胞的鉴定大多采用生化和分子生物学的方法，最常用的生化方法是同工酶分析，杂种的同工酶谱往往同时表现两亲本的特征酶谱，或出现两亲本所没有的新谱带。Guri等(1988)通过PGI和GOT的同工酶分析进行杂种鉴定。Gleddie等也成功地分析了杂种的AAP、6-DPGH和LAP同工酶。 常用的分子生物学方法有Southern印迹杂交、RFLP和RAPD等几种方法，Cecile Collonnier(2001)还采用过叶绿体微卫星分析的方法。用得最多的是Southern印迹杂交，用于杂交的DNA包括核DNA、叶绿体DNA(cpDNA)及线粒体DNA(mtDNA)。一般来说，在进行杂种鉴定时，为获得确切证据，往往需在生化分析(主要是同工酶分析)的基础上，同时进行分子生物学的分析。 在茄子的体细胞融合中，通常出现的问题是：体细胞杂种不育或育性较低，这限制了其在育种实践中的应用。在融合亲本的亲缘关系较远时，往往引起不对称的融合，但不对称融合有可能产生可育的体细胞杂种，这一点值得考虑。C.J. Jarl的结果证实了这一观点。
2 遗传转化 基因工程为茄子育种提供了一个新的工具，通过插入编码人们所期望性状的基因，使现存的品种得到改良或创造新的种质。由于茄子离体再生系统比较完善，对植株再生途径(即经过体胚还是经过愈伤组织器官化成苗)比较容易控制，而且转基因植株的再生效率能通过TDZ(0．1 m)、抗生素(如augmentin300g／ml、kanamycin 50 g／ml)提高，再者，茄子对以农杆菌为介导的共和载体(cointegrate vector)和双价载体(binary vector)的反应都很好，所以，茄子非常适合于这种技术的应用。自Guri(1988)成功地将NptⅡ基因转入茄子的基因组，获得转基因植株以来，茄子的转基因工程发展较快。 茄子在基因工程上所取得的成就主要体现在两个方面：一是抗CPB(Colorado Potato Beetle)。CPB是欧洲和北美的一个主要害虫，为得到CPB的抗性，将编码鞘翅目昆虫特定毒蛋白的基因导入茄子体内，但其表达量相当低，不能有效控制CPB。后来，Arpaia(1997)将经诱变得到的基因CryⅢB成功导入，表达量较高，经DAS-ELISA分析，93株中的57株叶片中有Cry Ⅲ B毒素，在测试的44株中有23株对CPB的幼虫有抗性，而且其自花授粉后代也显示了同样的抗性。转入工合成的基因CryIAb及CryⅢA也获得了相似的结果。 另一个方面就是得到了转基因的单性结实品系。Rotino等(1997)将单性结实基因iaaM置于特定于子房表达的启动子Def H9的控制下，导入茄子基因组内，结果表明，在未授粉、无外源激素、甚至在低温下，这种转基因茄子都能长出单性结实的无籽茄子，且其大小、重量与对照无差别。当授粉时，能结正常有籽的茄子。Donzella(2000)在未加温温室进行了试验，认为带单性结实基因的杂种茄子比未转基因的对照明显高产，在商业上有应用价值。 近来，Frijters等(2000)通过插入来自番茄的Mi-1基因，获得了对根结线虫具稳定抗性的转基因植株，另外，A．Szasz(1998)等成功地将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因导入茄子基因组内。
2．1 转化的受体类型 在茄子的基因工程中，大多使用无菌苗的嫩叶片作受体，其次就是胚轴、子叶，也有用茎作受体的。
2．2 转基因植株的检测 常用的检测方法主要有三种：一是对基因的表达产物的分析，如酶活性的分析、Western blot、DAS-ELISA，或是对基因表达产物毒蛋白进行毒性分析，或是对GUS等基因的表达产物所产生的颜色进行分析；二是应用分子生物学的方法对基因的转录产物的分析，如Northern blot；三是用分子生物学方法对基因本身的序列进行分析，常用的方法有PCR、Southern blot，也有用DNA slot blot、DNA dot blot。 对转基因植株的检测一般是上述几种方法的结合，有时还需进行田间试验，或者对转基因植株后代进行分析。
3 主要问题及展望
①茄子种间、属间的体细胞融合都获得了成功，得到了具野生种优良抗性的体细胞杂种。但存在的一个主要问题是：体细胞杂种的育性较低。虽然在这方面进行过一些尝试，如融合前的原生质体用射线、x射线照射，及通过不对称融合曾经获得了可育的体细胞杂种。今后宜探索新的物理化学方法或生物技术手段，以提高体细胞杂种的育性。另外，融合亲本也从种间扩展到属间，用具优良抗性的属间甚至是科间作为融合亲本，扩大应用的亲本范围，这一点值得考虑。
②茄子基因工程在其遗传育种、品质改良上的应用前景十分乐观，且已经取得了较大的进展，转基因茄子已经在生产上得到应用，但依然有许多不容忽视的问题存在。
a．目前已从茄子的幼苗外植体、原生质体和花粉(花药和小孢子)培养建立了再生体系，但用于遗传转化的只有幼苗外植体再生体系。从原生质体和花药和小孢子培养两条途径需进一步探索，特别是单倍性的小孢子或单倍性的愈伤组织和胚作为受体值得考虑。
b．采用的转化方法单一。基因转移的方法很多，如PEG法、载体法、电激法及基因枪法、浸种法和直接导入法。目前，在茄子中仅用载体法及直接导入法进行基因转移，为提高转化效率，今后可尝试其他的基因转移方法。
c．目前在茄子遗传转化方面取得较大成功的主要是抗虫及单性结实，但困扰茄子生产的还有真菌、细菌及线虫等病害，特别是茄子的青枯病及黄萎病两大病害，每年给茄子生产造成巨大损失。今后需扩大目的基因谱，使茄子遗传转化多方向展开，提高实际应用水平。
小孢子培养技术是大量获得单倍体的主要途径，目前已广泛应用于油菜等作物的遗传育种及转基因研究。通过小孢子培养获得的再生植株单倍体频率高，而单倍体往往不能被直接利用，需对其染色体进行加倍处理，使之成为可育的双单倍体(DH)植株。经国内外10多年来的努力，小孢子培养染色体加倍技术得到了迅速发展，可从早期分离的小孢子到后期大植株等不同时期进行染色体加倍处理，并逐渐发展形成了一套高效、安全、低毒的操作技术体系，其中秋水仙碱作为最实用、有效的加倍药剂而被广泛使用。 秋水仙碱(C22H25NO6)为水溶性生物碱，剧毒，分子量399.4，能抑制有丝分裂纺锤体的形成，主要影响染色体的配对，特别是作用于核膜中与秋水仙碱结合成分。秋水仙碱也作用于微管蛋白，能阻断微管蛋白聚合成微管。秋水仙碱是一种细胞分裂完全抑制剂，即可捕获分裂中期的染色质，阻止其进入分裂后期。目前我国在油菜小孢子培养方面的研究发展较快，在小孢子培养技术实际应用中，如何提高秋水仙碱的加倍效率、减少污染、降低生产成本等方面显得十分重要；其次，秋水仙碱所衍生的其它功能，如提高小孢子出胚产量、胁迫诱导出胚等也很有意义，而国内在这方面的研究相对较少。
1 染色体加倍技术研究
1.1 开花前处理 Polsoni等把处于初花期的单倍体植株从土壤中取出，洗根和切根后，用1g／L秋水仙碱水溶液在阳光下浸根5h，处理后再移植土中。Chen等在现蕾一初花前后用2g/L秋水仙碱浸根6-8h，获得53％的平均加倍率。Fletcher等认为，开花前用秋水仙碱加倍染色体有一些优点，如花前小孢子植株的单、二倍体易于区分；花前植株生长速度快，秋水仙碱通过根系吸收的效率最高。Fletcher等用3.4g/L秋水仙碱水溶液浸根或植株，在强光下处理1.5h，然后用自来水冲洗处理部位，再移人土中，处理植株存活率为96％,加倍频率为90％-96％。这种方法较适宜于无倍性检测仪器条件下应用，简单有效，但存在一些问题，如开花前处理的植株较大，存活率受影响，生长发育及其进程受抑，操作不便；使用的秋水仙碱浓度较高，产生待处置的废液多，费时费工。
1.2 土壤小植株处理 Lichter等对移到土中小植株的次生芽采用注入2g/L秋水仙碱的方法加倍染色体。Charne等和Swanson等取已入土的小植株浸根，用1-2g/L的秋水仙碱溶液(加2滴Tween-20可提高秋水仙碱效果)处理5-6h。Fletcher等将开花前处理加倍方法也用于较大植株的处理，即用3.4g/L的秋水仙碱浸根处理1.5h。Zhou等对2个F1代的单倍体再生植株用125mg/L秋水仙碱液浸根20h，加倍率分别为52％和56％；2周后对逃逸的单倍体再用3.4 g/L秋水仙碱浸根1.5h，以确保其加倍率。用此方法处理小植株必须事先已测定过其倍性，缺乏倍性检验仪条件则难以实行，因为此时单倍体与二倍体小植株在外观上难以区分。其次操作也较为复杂，要经历从洗根、浸根、再洗根到人土等多项步骤，较为费时费工，小植株也有一定损伤。此外，应用此方法对染色体加倍不完全，会产生较多单倍体与二倍体等的倍性嵌合体。
1.3 试管苗处理 针对土壤小植株用秋水仙碱处理费时的问题，Mathias等提出用试管苗进行直接处理，把3～4叶龄的带根再生小植株移人含50mg／L秋水仙碱的B5培养基中培养4-8d，再移至不含秋水仙碱培养基中无菌培养1-2周，其加倍频率超过50％。以试管苗作早期处理有利于整个植株的二倍化，处理植株的生长不受抑制；处理植株的花期早于非试管苗处理；所用秋水仙碱浓度低、数量少，因而可降低毒性和成本。此外，在双单倍体的生产中，对刚出管的小植株，Burnett等用1-2g/L秋水仙碱浸根2-4h，Ferrie等用3.4g／L秋水仙碱浸根1.5h，Guo等用2g/L秋水仙碱浸根2h，然后洗净后移入土中。试管苗加倍方法比前述方法省力，但在实际操作中存在两方面的问题，一是处理植株未进行倍性检测，会使部分自然加倍的二倍体再次加倍，成为多倍体或二倍体的嵌合体；二是试管小植株的倍性极不稳定，我们发现秋水仙碱处理过的小植株在移人土壤后其倍性会发生变化。
1.4 胚体处理 Chen等在光照下用1-2g／L秋水仙碱对15-20d的胚处理8-20h，二倍体发生频率15％-34％。Zhou等对移人固体培养前的5周龄胚状体用含25～50mg／L秋水仙碱液体培养15-30h，其二倍体植株频率为41.7％～44.7％。此法加倍效果较差，而且产生嵌合体和多倍体频率相对较高。另外，对2周龄大小的胚体(肉眼刚可见)在培养基中加入适量的秋水仙碱，振荡培养72h，也有一定的加倍效果。 1.5 小孢子处理 近几年来，直接用秋水仙碱处理刚分离小孢子以提高二倍体频率作了较多研究。Chen等在多个基因型中用0.5～1.0g/L秋水仙碱处理刚分离的小孢子8～20h，获得了37％～93％的二倍体加倍频率，平均加倍率达70％。MOiler等用50mg/L秋水仙碱处理24h后得到80％～90％的二倍体胚体，用较低浓度(10mg/L)秋水仙碱处理72h，二倍体胚体达80％，其再生的植株与正常的二倍体植株无差异。Zhao等用10mg／L秋水仙碱直接处理小孢子18h，获得22％的可育株，秋水仙碱连续培养的可育株为53％，而对照只有12％。但是不更换培养基会造成大量的畸形胚产生，转移到固体培养基后这些胚再生成小植株的比率会明显降低。Zhao等用10mg/L秋水仙碱处理42h后，再稀释至5mg/L培养，获得了90％的可育株。Hansen等比较秋水仙碱与其它解微管除草剂直接处理小孢子的加倍效果，发现用秋水仙碱400mg／L处理24h所得可育植株(二倍体)达94％，处理时间和浓度对染色体加倍具有极显著效应。Zhou等用50mg/L和500mg/L秋水仙碱处理15h，获得大量正常胚体，加倍频率达到75％～92％，且嵌合体和多倍体很少。研究表明利用分离小孢子直接进行秋水仙碱加倍染色体更为有效、完全和快速。
2 提高出胚产量 Zaki等研究了秋水仙碱直接处理小孢子对球形胚和子叶胚产量的影响，结果表明用秋水仙碱25mg/L处理12h能显著提高胚产量，长时间及高浓度处理会抑制胚产量，研究认为秋水仙碱作用于花粉第1次有丝分裂前期，促进了小孢子对等分裂数量，激活小孢子从配子体向孢子体发育。秋水仙碱直接处理小孢子对于小孢子反应差的基因型提高出胚潜力优于反应好的基因型。Iqbal等用秋水仙碱直接处理分离小孢子也得到类似结果，在57个试验中有69％的试验结果表明能提高出胚产量，最佳处理组合为100mg/L秋水仙碱培养24h，出胚数量比平均胚产量高出3倍；其次，长时间低浓度处理组合(10mg/L 72h)也有较好的效果，比平均胚产量高出1.8倍。但处理时间过长会产生不正常胚，对小植株的再生也有负面影响，10～20mg/L秋水仙碱处理18h未能提高小孢子的出胚频率。Hansen等分析了秋水仙碱直接处理分离小孢子的浓度与时间组合，表明不同浓度和时间对胚产量有极显著影响。中等浓度(1.2-40mg/L)能略微提高胚产量，当浓度高于120mg／L时对出胚有负作用，处理时间以12h为最好。Zhou等进一步证实了秋水仙碱直接处理小孢子对出胚产量提高的作用，用500mg/L秋水仙碱处理多个基因型15h，正常胚产量最高，比不处理对照提高70％-84％，萌发胚率也有显著提高。
3 诱导出胚研究 目前油菜小孢子培养技术体系中，小孢子常需30-33℃高温热击1-7d方能诱导出正常胚体。ZhaoL291提出了用秋水仙碱替代高温热击诱导小孢子出胚的新途径，这对研究小孢子的出胚机理具有重要意义。诱导方法是在25cC培养条件下先用秋水仙碱10mg／L直接处理刚分离的小孢子42h，而后将秋水仙碱浓度稀释至5mg／L直至培养出胚，小孢子胚发生频率占所培养小孢子数量的15％以上，经秋水仙碱诱导出胚的再生植株的二倍体率为90％，而热击诱导只有6％。由于经秋水仙碱处理的小孢子中热击蛋白HSPsl9和HSPs70均未被检出，据此Zhao假设HSPs不是小孢子诱导出胚的必要条件，HSPs的产生仅仅是细胞对高温的响应结果，它的作用可能是小孢子的存活和修复，而不是诱导出胚；进而假设花粉基因表达的抑制和结构重组是诱导小孢子出胚的真正机理。但有趣的是，以上推测与近来Srnykal等的试验结果不同。Smykal等人采用类似Zhao的方法，在20℃下用秋水仙碱诱导出胚，结果表明秋水仙碱直接处理小孢子诱导出胚率为2.3％，远远低于高温热击8.6％的出胚率，并检测出小热击蛋白sHSPsl7.6。通过非生物胁迫(如秋水仙碱)诱导小热击蛋白表达，是小孢子培养出胚的必要条件，但非充分条件。 周伟军等采用秋水仙碱与高温热击处理甘蓝型冬油菜F1杂种分离小孢子，获得了较高的出胚率和成苗率，即直接用500mg／L秋水仙碱对分离小孢子处理15h，并于32℃和30℃分别热击暗培养3d和7d后转入24℃下培养，胚胎发生良好，5周后产生大量正常胚体，将这些发育优异的胚体移人固体MS培养基后即进行10d低温(2℃)诱导，随后在常温(24℃)光照培养条件下能很好地萌发并直接、快速地再生成植株，其萌发胚率为89％和87％，成苗率为63％和55％。
4 展望
综上所述，秋水仙碱直接处理小孢子的加倍技术具有操作方便、省工省时、加倍效率高、废液少、嵌合体和多倍体比例低等优点，尤其适用于不具备多倍体检测设备的实验室应用，是油菜小孢子培养中一种最具应用前景的染色体加倍方法。但从有关文献和我们的实验中发现，秋水仙碱直接处理小孢子仍不能完全克服由于供体基因型等遗传差异性引起的某些材料的小孢子培养低反应问题，或表现对提高出胚及加倍效率不稳定等。因而较理想的稳妥加倍办法是前期秋水仙碱直接处理分离小孢子与后期花前植株处理相结合。此外，探索更为易行、安全、高效的加倍途径，如更低浓度、更低剂量、更高效率的替代方法也很有意义。对此，我们设想并已尝试对未分离小孢子进行某些预处理，发现在预处理时或预处理后能进一步提高出胚产量及加倍频率；同时应寻找具有更高加倍效率而低毒性的秋水仙碱替代物，以更好地用于遗传研究及育种实践。 由于非生物胁迫的秋水仙碱处理能诱导小孢子出胚，这对研究目前尚未清楚的小孢子培养出胚机理具有非常重要的意义。秋水仙碱能促进小孢子对等分裂，替代高温热击诱导出胚，秋水仙碱是否在油菜小孢子培养中还存在其它潜在功能?如调节培养液的渗透压、诱导性状变异和种质材料创新等等，这些研究有待进一步试验探索。
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